一．LMH細(xì)胞低血清培養(yǎng)基介紹

　　LMH細(xì)胞培養(yǎng)的營養(yǎng)需求高，易成簇成團生長，為解決這些問題，我們開發(fā)了一款干粉培養(yǎng)基，可以支持LMH細(xì)胞在3-5%血清濃度下均勻貼壁生長和維持。根據(jù)客戶反饋的結(jié)果：FAdV-4感染常規(guī)DMEM培養(yǎng)的LMH細(xì)胞時，滴度108TCID50/mL，使用本產(chǎn)品培養(yǎng)LMH細(xì)胞，病毒滴度可達到109TCID50/mL。

　　LMH細(xì)胞低血清培養(yǎng)基減少了血清用量，可使LMH細(xì)胞均勻貼壁生長，且提高了病毒產(chǎn)量，是一款適用于動物疫苗生產(chǎn)的培養(yǎng)基。

 

二．LMH細(xì)胞低血清培養(yǎng)基配液說明

　　LMH細(xì)胞低血清培養(yǎng)基規(guī)格：12.6g/L

　　添加物規(guī)格：0.3g/L

　　NaHCO3：1.8g/L

 

配制方法：

　　1.取適量細(xì)胞培養(yǎng)用水于配制容器中，預(yù)熱至37℃；

　　2.按規(guī)格稱量培養(yǎng)基粉末加入上述容器，攪拌30min至完全溶解；

　　3.再將添加物加入培養(yǎng)液中，攪拌至完全溶解；

　　4.將NaHCO3加入培養(yǎng)液中，攪拌至完全溶解；

　　5.使用1M NaOH或1M HCl調(diào)節(jié)培養(yǎng)液至所需pH值，定容；

　　6.用0.22μm孔徑濾膜或濾芯過濾除菌；

　　7.將過濾后的培養(yǎng)液置于4℃保存，存放周期4周。

三．LMH細(xì)胞傳代

　　以鋪滿單層的T25方瓶為例，去掉培養(yǎng)基，加入1.5mL 0.05%胰酶，輕輕潤洗，快速去掉胰酶，常溫放置約15s或培養(yǎng)箱放置1min左右（胰酶沒有提前預(yù)熱），放置時間可根據(jù)細(xì)胞狀態(tài)適當(dāng)調(diào)整，待細(xì)胞消化完全，出現(xiàn)明顯間隙時，用含血清培養(yǎng)液終止消化，吹打均勻后分種比例1:3或1:4，LMH細(xì)胞低血清培養(yǎng)液體積6mL/瓶，培養(yǎng)時間2-3天。

胰酶配方	NaC1	8g/L	KC1	0.4g/L
	NaHC03	0.58g/L	EDTA·2Na	0.2g/L
	胰酶	0.5g/L	葡萄糖	1g/L

四．LMH細(xì)胞凍存

　　1.細(xì)胞凍存液：10%二甲基亞砜+90%血清；

　　2.凍存密度:2.0×106cells/mL-3.0×106cells/mL；

　　3.取待凍存的細(xì)胞（按上述細(xì)胞傳代方法把貼壁細(xì)胞消化下來），1000rpm離心5min，棄上清；

　　4.細(xì)胞用配制好的凍存液吹打混勻，分裝至凍存管（提前標(biāo)記好細(xì)胞名稱、凍存時間）；

　　5.凍存管放入已加異丙醇的凍存盒中，-80℃超低溫冰箱過夜，然后轉(zhuǎn)入液氮保存。

五．LMH細(xì)胞復(fù)蘇

　　1.以T25方瓶為例，取一個T25方瓶，加入含血清培養(yǎng)液6mL，待用；

　　2.從液氮容器中取出凍存管，浸入40℃溫水中，并一直搖動使其盡快融化，注意液面不要沒過凍存管管口；

　　3.融化后的細(xì)胞懸液用移液器稍吹打后，轉(zhuǎn)入T25方瓶，搖勻后置于37℃5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；

　　4.過夜后，小心取出方瓶，剛復(fù)蘇細(xì)胞貼壁性差，會有大部分漂浮細(xì)胞，將方瓶中液體轉(zhuǎn)移至無菌離心管1000rpm離心5min，方瓶中加入含血清的培養(yǎng)液6mL，離心后棄上清，取方瓶中培養(yǎng)液吹打混勻，重新加入方瓶中（建議采取下午復(fù)蘇細(xì)胞，次日早上進行換液；也可上午復(fù)蘇細(xì)胞下午換液）；

　　5.換液后，細(xì)胞會在48h內(nèi)貼壁，但生長會很緩慢，很難長滿單層，可將細(xì)胞消化重懸或在48h左右進行換液。

　　注：LMH細(xì)胞復(fù)蘇后貼壁慢，重懸后1~2代生長緩慢屬于正?，F(xiàn)象，若需試驗請?zhí)崆皬?fù)蘇細(xì)胞，待細(xì)胞生長穩(wěn)定后試驗。

六．試劑及相關(guān)數(shù)據(jù)

	試劑	級別	濃度
百諾吉	新生牛血清	特級	3%
	胰酶	進口細(xì)胞級	0.05%
	EDTA·2Na	AR	0.02%

 

培養(yǎng)器皿	培養(yǎng)時間	傳代比例	接毒維持液	收獲毒價
T25方瓶	48h	1:3/1:4	LMH低血清培+0.5%NBS	109TCID50/mL
轉(zhuǎn)瓶	72h	1:3-1:5	LMH低血清培+0.5%NBS	109TCID50/mL

 

七．部分廠家應(yīng)用情況介紹

廠家	細(xì)胞來源	培養(yǎng)方式	生長液	傳代比例	維持液	抗原	毒株毒價（TCID50/1ml）
百諾吉	百諾吉	轉(zhuǎn)瓶	LMH01+3%NBS	1:3-1:4（48h）	LMH01+0.5%NBS	FADV-4	≥9.0
A廠家	百諾吉	轉(zhuǎn)瓶	LMH01+5%FBS	1:4-1:5	LMH01+0.5%NBS	FADV-4	≥8.5
B廠家	百諾吉	轉(zhuǎn)瓶	LMH01+5%NBS	1:3-1:4	LMH01+0.5%NBS	FADV-4	≥9.2
C廠家	百諾吉	轉(zhuǎn)瓶	LMH01+2%NBS	1:3-1:4	LMH01+2%NBS	FADV-4	≥8.4
D廠家	百諾吉	紙片載體	LMH01+3%NBS	1:3-1:4	LMH01+0.5%NBS	FADV-4	≥8.0
E廠家	百諾吉	轉(zhuǎn)瓶	LMH01+5%NBS	1:3-1:4	LMH01+0.5%NBS	FADV-8	≥8.3
F廠家	百諾吉	轉(zhuǎn)瓶	LMH01+2.5%NBS	1:5-1:6	LMH01+0.5%NBS	FADV-11	≥8.0
G廠家	百諾吉	轉(zhuǎn)瓶	LMH01+4%NBS	1:3	LMH01+0.5%NBS	FADV-4	≥8.5
H廠家	百諾吉	轉(zhuǎn)瓶	LMH01+5%NBS	1:3	LMH01+0.5%NBS	FADV-4	≥8.3